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病原体测序建库方案

LAMP技术为何收到追捧？

近年来，基于等温扩增的核酸检测技术已大量建立并广泛应用于人类疾病检测中。其中，环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, 下文统称LAMP）关注度尤为突出，拥有接近一半的恒温检测市场占有率。 LAMP技术是日本学者Notomi在2000年发明的，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物。在链置换酶Bst DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下，与特殊设计的引物形成“环”结构，在60~65℃进行恒温扩增，大约15~60分钟就可实现10^9~10^10倍的核酸扩增，操作简单。其优点为快速高效，且无需专业的设备，弥补了传统PCR技术的不足。   简单快速 传统升降温式PCR扩增DNA片段分3个阶段，变性、退火和延伸，每个阶段对应不同的温度，高温（95℃）变性，DNA双链变成单链；降温（60℃）退火，引物与模板互补配对；适温（72℃）延伸，形成新的DNA双链。每经历这三步就是一个PCR反应循环，DNA量翻一番，PCR通常做30-45个循环，反应时间长达40分钟到2个小时，且升降温式PCR对于仪器的要求较高。 LAMP等温扩增技术则不需要热循环系统，就可以进行核酸扩增，在其扩增阶段，利用4种特异引物和高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，如果再添加环状引物，20~30分钟后即可检测到扩增产物。相比于常规PCR需要经过严格的变性、退火、延伸等步骤才能模拟体外的DNA分子扩增，LAMP反应时间更短、且对操作和仪器要求更低。   应用范围广 LAMP是检测界中的后起之秀， 已逐步用于包括DNA病毒、RNA病毒、细菌和寄生虫等的定性检测。在新冠病毒、HIV病毒、流感病毒、埃博拉病、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒等领域都得到了广泛的应用。业内玩家已先后开发出多种商业化LAMP试剂盒，使检测成本进一步降低，促进了LAMP技术的普及，为基层及没有实验室条件的地区进行现场快速检测（POCT）提供了方便。 特异性和灵敏度媲美PCR 相比PCR，等温扩增的特异性和灵敏度稍低，但通过优化反应可实现高特异性和高灵敏度。  案例一 Chukwunonso O. Nzelu等人总结检测人利什曼病的14个LAMP方法中，灵敏度在80%~100%之间，特异性在94%~100%之间，灵敏度和特异性都＞90%的占比超过一半。 参考文献：https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007698   案例二 Barbara J. Bucher等人对比LAMP和PCR方法检测犬粪便中多房棘球绦虫卵，发现通过优化DNA的提取方法，可以使LAMP方法的灵敏度达到甚至超越PCR。 参考文献：https://doi.org/10.3390/pathogens10070847   美格生物LAMP系列产品推荐   Bst DNA聚合酶，大片段（货号:D001） 反应快速 Bst DNA聚合酶是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有 5’→3’ DNA聚合酶活性，以及很强的链置换活性，缺失5’→3’ 核酸外切酶活性。可用于LAMP等温扩增反应。 使用美格生物Bst Pro DNA Polymerase, Large Fragment，和供应商N的Bst对结核杆菌进行扩增反应，对比扩增10^5, 10^4, 10^3copies的靶标，结果显示两者性能一样优秀。 Bst Pro DNA 聚合酶，大片段（货号:D006） Bst Pro DNA 聚合酶对野生型Bst DNA聚合酶进行了特异性改造，保留了野生型的全部特性之外可以使用50%的dUTP为原料进行扩增反应。   LAMP 扩增预混液（染料型）（货号:F001） 使用美格生物的LAMP 扩增预混液对非洲猪瘟病毒（ASFV）进行扩增，检测可达10copies/反应，且稳定检出。图中从左到右分别是对10000,1000,100,10拷贝数扩增得到的扩增曲线。 美格生物LAMP系列产品列表
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2022-09

CRISPR快讯 第四期

发布时间： : 2022-09--23
具有最小附属切割活性的高保真Cas13变体靶向RNA降解 科学家报告了一种新型双荧光报告系统，用于检测哺乳动物细胞中的附属切割活性和筛选Cas13变异体。该团队分析了200多个工程化Cas13变体后发现了其中几个（包括Cas13d和 Cas13X）表现出有效的靶向活性，但附属切割活性显著降低。他们还发现，这些变体不存在由Cas13诱导的转录组范围的脱靶和细胞生长停滞。作者得出结论，具有最小附属切割活性的高保真Cas13变体现在可用于基础研究和治疗应用中的 RNA 靶向降解。
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2022-08

CRISPR快讯 第三期

发布时间： : 2022-08--17
CRISPR快讯Vol.3 用于一管法新冠检测耐热Cas13酶的特性耐热Cas13同源物将扩大和解锁CRISPR系统在合成生物学和生物技术应用中的贡献。本文从Thermoclostridiumcaenicola中鉴定并表征了一种耐热Cas13同源物(TccCas13a)，该同源物在37-70°C的广泛温度范围内表现出良好的顺式和反式切割活性。为了证明耐热Cas13酶在生物技术应用中的实用性，文章将
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2022-08

CRISPR快讯 第二期

发布时间： : 2022-08--17
CRISPR快讯Vol.2 免扩增数字RNA自动检测平台用于快速、灵敏地诊断SARS-CoV-2在当前的COVID-19大流行中，快速、灵敏地诊断病毒感染是遏制病毒传播的关键。为此，本文利用CRISPR-Cas13a和微室装置(opn-SATORI)开发了一种自动免扩增的数字RNA检测平台，该平台可在9分钟内自动完成临床标本从混合样本到RNA定量的检测过程。opn-SATORI采用Cas13a和磁
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2022-08

CRISPR快讯 第一期

发布时间： : 2022-08--17
CRISPR快讯Vol.1 生物强化西红柿为获取充足维生素D提供新途径-2022/5/23研究人员发现使用CRISPR-Cas9对西红柿进行基因编辑，可能是持续获取维生素D的新方法。通过CRISPR-Cas9基因编辑关闭西红柿基因组中特定基因Sl7-DR2来增加番茄果实和叶子中的维生素D3原的积累，而人皮肤暴露于紫外线下可以将维生素D3原转化为维生素D3。此方法可以应用于其他植物，如茄子、马铃薯和胡椒等，这为解决全世界将近10亿人缺乏维生素D这一巨大健康问题提供了可能。 来源：NaturePlantshttps://doi.org/10.1038/s41477-022-01154-6  DIPA-CRISPR，一种简单易操作的昆虫基因编辑方法-2022/5/23研究人员使用“直接亲本”CRISPR(DIPA-CRISPR)技术在蟑螂（德国小蠊）中进行基因编辑。实验表明将Cas9核糖核蛋白(RNP)注射到成年雌性蟑螂的血腔中，无需注射到胚胎，就可以有效地在发育中的卵母细胞中引入可遗传的突变。商业化的标准Cas9蛋白可以直接用于DIPA-CRISPR。DIPA-CRISPR的简单和可获取性将极大地扩展基因编辑技术应用到各种昆虫。 来源：CellReportsMethodshttps://doi.org/10.1016/j.crmeth.2022.100215  Cas9细胞外囊泡，一种新型基因编辑工具-2022/5/18研究人员开发出包含Cas9蛋白的细胞外囊泡（EV）作为一种新型基因编辑工具。在HEK293细胞中，每个EV可以加载大约25个Cas9蛋白分子，Cre报告基因和PCSK9基因的基因编辑效率分别为51%和6%。 来源：JournalofExtracellularVesicleshttps://doi.org/10.1002/jev2.12225 CRISPR/Cas13a辅助放大磁弛豫生物传感用于检测人血清中的miRNA-21-2022/5/29研究人员使用CRISPR-Cas13a信号放大系统来提高对人血清中特定miRNA检测的灵敏度。该系统采用磁弛豫开关(MRS)的方式直接检测样品中的miRNA，60分钟内检测限为0.22pM。CRISPR/Cas13a系统辅助MRS检测成功实现了复杂样本中miRNAs的准确、简单、快速检测，显示出在潜在的临床应用中检测miRNAs的巨大潜力。 来源：TrACTrendsinAnalyticalChemistryhttps://doi.org/10.1016/j.aca.2022.339853 使用新型SNP快速鉴定炭疽杆菌-2022/5/16炭疽杆菌是炭疽病的病原体，是一种致命的疾病和潜在的生物威胁。研究人员开发了一种重组酶聚合酶扩增（RPA）和Cas12a结合的快检方法，利用八个新型SNP位点对炭疽杆菌进行快速的即时现场鉴定。这种简单可靠的方法，利于当地医院和公共卫生项目快速检测炭疽杆菌。 来源：MicrobiologySpectrumhttps://doi.org/10.1128/spectrum.02285-21 比例荧光探针:基于CRISPR/cas12的生物传感平台的一种灵敏可靠的报告器-2022/5/3研究人员设计了一个比例荧光探针作为基于CRISPR/cas12的系统的报告器。实验选择荧光素(FAM)和四甲基罗丹明(TAMRA)作为两种荧光染料，分别标记5端和3端一个短的ssDNA，设计为一个比例荧光探针。当比例探针在480nm处激发时，借助FRET效应，探针发出580nm的TAMRA荧光。激活的Cas12a可以切割双标记的ssDNA，导致TAMRA的荧光降低，FAM的荧光增加。这种双响应荧光探针可以作为基于CRISPR/cas12的生物传感平台的报告器。与传统的TaqMan相比，以比例探针为报告器的CRISPR/cas12生物传感不仅具有更高的灵敏度，而且能够区分和避免假阳性信号。 来源：Analysthttps://doi.org/10.1039/D2AN00613H 通过CRISPR-Cas12a辅助级联扩增探测低丰度DNA甲基化-2022/5/3异常的DNA甲基化在肿瘤的发生和转移中起着重要的作用，被认为是一种有价值的非侵袭性癌症生物标志物。本文提出了一种易于操作的CRISPR-Cas系统辅助甲基化(CAM)方法，通过结合滚环（RCA）扩增和CRISPR-cas12a辅助级联扩增，对DNA甲基化进行灵敏检测。该方法具有高灵敏度，可以区分低至0.01%的甲基化水平，为加速基于甲基化癌症诊断和管理铺平了道路。 来源：Analysthttps://doi.org/10.1039/D2AN00170E
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2022-08

新学期新思路，美格生物CRISPR蛋白钜惠促销

发布时间： : 2022-08--17
开学啦！ 美格生物竭诚为广大学子的新学期保驾护航！自8月16日起至9月30日，美格生物CRISPR蛋白系列Cas9蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白、Cas13a蛋白、Cas14a蛋白、T7 核酸内切酶 I展开限时促销活动，选购得好礼，快来看看吧！ Cas9 蛋白 用于基因编辑，纯蛋白体系 Cas9-NLS可在sgRNA介导下，识别PAM序列NGG位点，特异性切割DNA双链。凭借其纯蛋白无干扰、低毒的安全特点，广泛用于基因编辑，可用于基因敲除和多靶点精确编辑DNA, 以Cas9核糖核蛋白RNP形式进入个体内或细胞中编辑，比如培养模式动物。   Cas12a 蛋白 附属切割活性强，分子诊断优选 在CRISPR诊断蛋白中，Cas12a（又称Cpf1）是在sgRNA引导下与靶标DNA特定位点结合并切割的核酸内切酶。Cas12a蛋白具有较为高效的附属切割活性，能够在较少用量的环境下实现对于DNA检测的信号放大，可与RDA、LAMP、PCR等方法搭配使用。在诊断应用中，当Cas12a检测并切割特定的目标DNA序列时，其高效切割任意ssDNA序列的活性被激活，该性质使其广泛用于各种病原体的核酸检测，例如用于人乳头瘤病毒和新型冠状病毒肺炎检测。 Cas12b 蛋白 附属切割活性强，分子诊断优选 Cas12b同样是一种依赖sgRNA介导的核酸内切酶，但其在45-65℃的中高温环境中具备更高的切割活性。Cas12b在sgRNA引导下识别并切割靶标双链DNA时，其“附属切割”活性会被激活，并高效地切割体系中的任意序列ssDNA，该性能使其逐渐流行于分子诊断领域。 Cas13a 蛋白 切割活性强 Cas13a在sgRNA引导下，可以识别并切割体系中的特异单链RNA。在切割特定RNA序列后，其“附属切割”活性会被激活，可高效地切割体系中的任意序列ssRNA。通过设计两端标记荧光基因或者其他标记物的RNA探针，可实现CRISPR/Cas13对RNA模板的检测和信号放大。当cas13a与靶标RNA结合时，它通过切割RNA探针释放荧光信号，来检测靶标RNA的存在，可用于诊断黄病毒，如寨卡病毒，登革热，西尼罗病毒和黄热病。 Cas14a 蛋白 特异性更高 Cas14a主要用于分子诊断。在CRISPR诊断蛋白系列中，Cas14a蛋白较小，比Cas9蛋白小两倍。Cas14a不受PAM位点限制，识别ssDNA序列的特异性更高，非常适用于SNP基因分型。 T7 核酸内切酶 I 常用于基因编辑结果验证 T7核酸内切酶 I，英文学名T7 Endonuclease I，可用于识别并切割不完全配对、十字形结构、交叉的以及异源双链的DNA；和缓慢切割带有切刻缺口的双链DNA。T7 核酸内切酶 I可用于基因突变、SNP、TALEN或CRISPR/Cas9形成的突变体检测，并识别错配DNA，分解四方向交叉DNA或分支DNA。 产品列表  CRISPR-Cas系列 活动时间： 2022年8月16日- 9月30日（初定）   活动规则： 1.活动期间下单并顺利确认订单的客户即可参加，不含经销商客户； 2.新客户下单额外赠送小米无线鼠标一个 3.活动期间购买试剂满2000元可申请 智能蓝牙音箱一个，满5000可申请空气炸锅一个，满8000可以申请SK-II大红瓶一份 4.关注美格公众号并在微信朋友圈转发美格开学季促销活动集齐50个赞，可申请李宁计数跳绳好礼一份 5.本活动最终解释权归广州美格生物科技有限公司所有  
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