长期以来，体育竞技中的兴奋剂滥用问题备受关注。随着基因编辑技术的发展，基因兴奋被认为是反兴奋剂领域的下一个前沿阵地。基因兴奋剂的使用不仅违反了体育竞技的公平原则，也对运动员的健康构成严重威胁。

先前针对基因兴奋剂的检测方法主要包括PCR、NGS等，这些方法通常需要昂贵仪器设备和专业的操作人员，限制了其在基因兴奋剂现场检测中的使用。近几年，基于CRISPR-Cas12a的核酸检测方法因其高特异性、高灵敏度和便于即时检测的特性在体外诊断中得到广泛应用，这也为基因兴奋剂的检测提供了新的思路。 

 在实际应用中，基于CRISPR-Cas12a的核酸检测技术常常结合RPA等核酸扩增技术对待测靶标进行扩增，从而进一步提高检测的灵敏度。在我们之前的工作首先展示了CRISPR-Dx在基因兴奋剂检测方面的潜力，但额外的转移步骤可能会导致气溶胶问题，并在实际应用中影响性能。因此，出现了几种策略来规避在CRISPR-Dx期间对样品转移的需要。这些方法包括使用复杂的微通道来分离试剂，或者设计特殊的刺激物来依次进行扩增和检测分析，此外，也有一些研究人员提出了一锅CRISPR-Dx系统，但需要细致的生物分子设计和筛选来优化条件。

在这项研究中，我们开发了一种集成微流控装置（称为MGD-Chip），设计用于使用CRISPR-Cas12a技术进行基因兴奋剂的快速，多路和现场检测。该设备具有简单的通道设计和亲水/疏水修饰，以简化样品装载并最大限度地减少RPA扩增和CRISPR检测之间的干扰。该平台可以同时检测6种基因兴奋剂相关基因（VEGFA、HIF1、ACTN3、EPO、GH1和IGF1）。我们的结果显示该平台具有优异的检测特异性和灵敏度，并通过两种小鼠模型验证了该平台检测真实样本中基因兴奋剂存在的有效性。这项工作强调了通过亲水/疏水修饰，集成微流控芯片和CRISPR技术，在实现基因兴奋剂高效、多路和现场检测方面的潜力。

该项研究成果2024年8月3日以题为“Hydrophilic/hydrophobic modified microchip for detecting multiple gene doping candidates using CRISPR-Cas12a and RPA”发表于国际期刊Biosensors and Bioelectronics。

Fig. 1. 检测平台的工作原理。（a）针对基因兴奋剂靶标的crRNA和RPA引物的设计。（b）微流控芯片的设计。（c）MGD-Chip检测平台的工作流程。

Fig. 2. 对六种crRNA和多重RPA性能的全面评估。（a）六种crRNA×六种GD质粒的矩阵反应性测试。荧光检测结果以热图形式展示。（b）琼脂糖凝胶电泳图像显示了使用不同RPA引物分别扩增六种靶标的RPA产物。（c）通过变性 PAGE 胶进行多重 RPA 扩增和检测特异性验证（d）热图展示了通过Cas12a检测 3-plexed RPA和6-Plexed RPA产物的荧光信号。

Fig. 3. 检测灵敏度分析。（a）在未扩增条件下检测六种靶标的灵敏度。（b）示意图展示了经多重RPA后对六种靶标的检测灵敏度分析。（c）热图显示了基于CRISPR-Cas12a的不同浓度的靶标经6-plexed RPA后的检测结果。

Fig. 4. MGD -Chip的表征。（a）微流控芯片五层结构的示意图。（b）芯片上亲水性和疏水性处理位置的示意图（上图）。荧光图像展示了亲水性和疏水性处理的效果（下图），荧光素（绿色）和磺胺B（红色）表示了液体流动。（c）未经过疏水性修饰和经过疏水性修饰后芯片通道中溶液的回流比较。（d）荧光图像显示了芯片上荧光素（绿色）和磺胺B（红色）溶液的混合性能（上图）。使用荧光素评估芯片均分溶液的能力。（下图）。（e）加热膜和芯片随着加热时间的温度变化。

Fig. 5. 芯片上经 RPA 后检测血清样本中的基因兴奋剂灵敏度测试。（a）示意图显示血清样本中的基因兴奋剂检测的流程。（b）评估该平台检测六个靶标的灵敏度。*、**、***分别表示统计检验中 P 值分别小于 0.05、0.01 和 0.001。

Fig. 6. 通过IGF1和EPO小鼠模型验证MGD-Chip检测平台的可行性。（a）小鼠模型实验的示意图。（b）在不同浓度的 IGF1 转基因小鼠样本中检测荧光信号随时间的变化（c）在芯片上检测 IGF1 转基因小鼠第 8 天的样本的荧光信号（d）在不同浓度的 EPO 小鼠模型样本中检测荧光信号随时间的变化。（e）在芯片上检测 EPO 小鼠模型第 3 个小时的样本荧光信号。