当Cas12a识别dsDNA靶时，需要在靶区附近具有特定序列(5’-TTTV-3’)的原间隔基序(PAM)位点。然而，许多基因突变相关疾病在突变区附近几乎没有PAM位点，尤其是SNVs。此外，尽管这样的PAM位点存在于SNV（单核苷酸突变）附近，但SNV的位置可能不在Cas12a/crRNA复合物识别的种子区，这使得CRISPR-Cas12a系统对SNV不敏感，这极大地限制了其适用性、灵活性和可及性。因此，开发一种新的策略来克服PAM位点的限制而不损害SNV分析的检测灵敏度是至关重要的。

实验方法：我们介绍了一种基于CRISPR-Cas12a系统的通用、稳健和高保真的PAM非依赖性SNV分析方法，名为TRACER (mutant Target-Recognized PAM-independent CRISPR-Cas12a Enzyme Reporting system)。在这种策略中，核酸扩增反应的dsDNA产物通过碱性溶液或高温的处理被解旋，以产生大量的ssDNA在用酸中和或冷却到特定温度后，ssDNA被CRISPR-Cas12a系统靶向，而不需要PAM位点。一旦被激活，CRISPR-Cas12a系统可以切割FQ报告探针，产生荧光信号。

图1 TRACER原理图。(a)dsDNA扩增子转化为ssDNAs，CRISPR-Cas12a系统可以识别ssDNA，而不需要PAM位点来产生放大的荧光信号。(b)从肿瘤组织中提取的基因组DNA通过PCR或RPA扩增，并在BA或HC处理后使用CRISPR-Cas12a系统检测，由于与crRNA的更多错配，WT靶标不能产生明显的荧光信号。

结果：TRACER可以在低至0.5aM的浓度下有效地区分靶核酸，从而使其能够鉴定杂合子中0.1%突变型(MT)基因的存在。最后检测了27例乳腺癌(ESR1基因)和30例非小细胞肺癌(非小细胞肺癌，EGFR基因)的肿瘤组织样本，显示出与Sanger测序相当的灵敏度、特异性和准确性。

图2 BA-/HC-TRACER的敏感性分析。(a)BA-/HC-TRACER中通过PCR扩增的靶DNA。(b)BA-TRACER中通过PCR扩增的靶DNA的荧光动力学分析。(c)HC-TRACER中通过PCR扩增的靶DNA的荧光动力学分析。(d)BA-/HC-TRACER的荧光强度对比。(e)靶标浓度的对数与BA-/HC-TRACER的荧光强度之间的关系。

图

3 用TRACER分析SNVs。(a)乳腺癌中的耐药性ESR1-Y537S突变及其相应的crRNA。(b)用于识别SNV的各种crRNAs的设计。(c)在BA-/HC-TRACER中使用设计的四种crRNAs进行ESR1-Y537S突变检测的荧光强度。(d)使用BA-/HC-TRACER中的crRNA3检测不同浓度的ESR1-Y537S MT和WT基因。(e)使用BA-/HC-TRACER中的crRNA3检测具有不同比例的ESR1-Y537S MT与WT基因的混合物。(f)非小细胞肺癌的EGFR-S768I突变及其相应的crRNA。(g)在BA-/HC-TRACER中使用设计的crRNA的EGFR-S768I MT和WT基因的荧光动力学曲线。(h)使用BA-/HC-TRACER中设计的crRNA检测不同浓度的EGFR-S768I MT和WT基因。(I)使用BA-/HC-TRACER中设计的crRNA检测具有不同比例的EGFR-S768I MT与WT基因的混合物。

图4 TRACER的临床验证。(a)使用TRACER检测临床样本中的ESR1-Y537S和EGFR-S768I突变的工作流程。(b，c)使用BA-TRACER(b) 和HC-TRACER(c)检测ESR1-Y537S突变的荧光动力学曲线。(d)两个临床群组的TRACER检测结果，包括7个ESR1 MT样本和20个ESR1 WT样本。(e，f)使用BA- (e)和HC-TRACER检测EGFR-S768I突变的荧光动力学曲线(f)。(g)两个临床组群的TRACER检测结果，包括12个MT EGFR样本和18个WT EGFR样本。 (h，I)用于检测临床样品中ESR1-Y537S和EGFR-S768I突变的BA-TRACER(h)和HC-TRACER(I)的ROC曲线。(j，k)通过使用混淆矩阵与Sanger测序进行比较，评估TRACER的临床敏感性、特异性和准确性。

优点：TRACER为不依赖于PAM位点的SNV分析提供了一个新的视角，有效地拓宽了CRISPR-Cas12a系统的适用性，因此在临床诊断、生物医学研究和药物发现方面具有巨大的潜力。

团队介绍：熊二虎，“潇湘学者”特聘教授，博士生导师，湖南大学/美国德克萨斯大学奥斯汀分校联合培养博士(导师：陈金华和Andrew D. Ellington教授)，湖南省杰出青年基金项目(青年A类)获得者，湖南省青年科技人才-荷尖人才 (2022年)，湖南省化学化工学会第十九届青年化学化工奖 (2023年)，湖南省湘江新区青年科技工作者联合会理事 (2024年)，J. Anal. Test.和IMed期刊青年编委 (2024年)。2019年3月-2022年2月在华南师范大学生命科学学院工作，2022年3月加入到湖南师范大学化学化工学院。目前主持国家自然科学基金面上和青年项目各1项，省部级项目多项，授权中国和美国发明专利各1件，申请中国发明专利6件。近年来，共发表学术论文40余篇，其中以第一/通讯作者身份在Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., JACS Au, Natl. Sci. Rev., CCS Chem., Sci. China Chem., ACS Nano, Anal. Chem.等国际权威期刊上发表论文28篇，5篇ESI高被引论文，2篇热点论文。研究成果发表后，受到国内外相关领域著名专家和学者的广泛关注，并在Chem. Rev., Chem. Soc. Rev., Nat. Biomed. Eng.等国际权威期刊上给予大篇幅引用和肯定性评价。