使用AlphaFold 3优化CRISPR/Cas12f1引导RNA以增强核酸检测

CRISPR/Cas12f1系统以其独特的反式切割活性而闻名，已成为一种有前景的工具核酸检测。然而，Cas12f1中引导RNA的优化仍然是一个关键挑战。本文采用了尖端的人工智能驱动的结构预测工具AlphaFold 3通过策略性指导RNA修饰提高Cas12f1核糖核蛋白（RNP）复合物的检测效率。这种方法提供了一种新颖有效的策略来提高CRISPR技术在各种诊断应用中的应用，以推进更有效的CRISPR/Cas12f1生物传感系统的开发核酸检测。

实验目的

本研究旨在优化CRISPR/Cas12f1系统中的guide RNA (gRNA)，以增强其核酸检测能力。利用AlphaFold 3进行结构预测，优化tracrRNA和crRNA的设计，以提高Cas12f1核糖核蛋白（RNP）复合物的trans-cleavage活性，从而提升检测灵敏度和特异性。

实验方法

结构模拟与优化

采用AlphaFold 3对野生型tracrRNA和crRNA进行结构模拟，分析其结构对Cas12f1活性的影响。

发现tracrRNA 3'端的内部配对影响了其与crRNA的结合，因此设计并测试了3'端截短的tracrRNA。

进一步将优化后的tracrRNA与crRNA连接，设计单一guide RNA (sgRNA)，并进行结构模拟分析其稳定性。

图2.TracrRNA优化和优化的tracrRNAs和Cas12f1 RNPs的结构模拟。A.通过删除3′端核苷酸优化TracrRNA包括AUGCAA，以及tracrRNA内成对核苷酸的变化（绿色，78-UUGCAU-83）。B.截短的tracrRNA（绿色）和crRNA（红色）的结构它们之间有成对的核苷酸，包括tracrRNA中的78-UUGCAU-83（绿色）和crRNA（红色）中的11-AUGCAA-16（左），tracrRNA（绿色）中的134-UUCAUU-139crRNA中的2-AAUGAA-7（红色）（右）。C.Cas12f1 RNP的3D结构，具有截短的tracrRNA和tracrRNA（绿色）和crRNA之间的成对核苷酸（红色），包括tracrRNA（绿色）中的78-UUGCAU-83和crRNA（红色）中的11-AUGCAA-16（左），tracrRNA中的134-UUCAUU-139（绿色）和crRNA中的2-AAUGAA-7（红）（右）。紫色：Cas12f1蛋白；绿色：tracRNA；红色：crRNA；蓝色：ssDNA触发器。（为了解释本图图例中对颜色的引用

读者可以参考本文的网络版本。）

活性检测

采用荧光报告系统检测Cas12f1 RNP的trans-cleavage活性，比较不同gRNA（野生型tracrRNA、截短tracrRNA、sgRNA）对Cas12f1活性的影响。

通过LOD (Limit of Detection) 测试评估检测灵敏度。

采用琼脂糖凝胶电泳进一步验证不同gRNA的酶切活性。

实验结果

结构模拟显示，野生型tracrRNA的3'端形成错误配对，导致Cas12f1活性降低。

通过截短tracrRNA的3'端，改善其与crRNA的结合，提高Cas12f1的trans-cleavage活性，检测灵敏度提高100倍（LOD从1 nM降至10 pM）。

采用sgRNA进一步优化结构，使Cas12f1活性较截短tracrRNA系统提高约2.2倍，并改善信噪比（S/N = 5.8 vs. 1.4）。

研究优点

创新性：首次利用AlphaFold 3进行CRISPR/Cas12f1 gRNA优化，提供了一种基于结构预测的设计策略。

提高检测灵敏度：优化后系统的LOD显著降低（10 pM），适用于高灵敏度核酸检测。

简化gRNA设计：通过sgRNA设计取代传统的tracrRNA-crRNA双组分，提高了系统的稳定性和活性。

广泛适用性：AlphaFold 3的建模方法可推广至其他CRISPR/Cas系统，提高整体CRISPR技术的检测效率。