cas9、cas12、cas13、cas14蛋白所延伸的分子诊断技术

近年来，基于等温扩增的核酸检测技术已大量建立并广泛应用于人类疾病检测中。其中，环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, 下文统称LAMP）关注度尤为突出，拥有接近一半的恒温检测市场占有率。

LAMP技术是日本学者Notomi在2000年发明的，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物。在链置换酶Bst DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下，与特殊设计的引物形成“环”结构，在60~65℃进行恒温扩增，大约15~60分钟就可实现10^9~10^10倍的核酸扩增，操作简单。其优点为快速高效，且无需专业的设备，弥补了传统PCR技术的不足。




 

简单快速







传统升降温式PCR扩增DNA片段分3个阶段，变性、退火和延伸，每个阶段对应不同的温度，高温（95℃）变性，DNA双链变成单链；降温（60℃）退火，引物与模板互补配对；适温（72℃）延伸，形成新的DNA双链。每经历这三步就是一个PCR反应循环，DNA量翻一番，PCR通常做30-45个循环，反应时间长达40分钟到2个小时，且升降温式PCR对于仪器的要求较高。

LAMP等温扩增技术则不需要热循环系统，就可以进行核酸扩增，在其扩增阶段，利用4种特异引物和高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，如果再添加环状引物，20~30分钟后即可检测到扩增产物。相比于常规PCR需要经过严格的变性、退火、延伸等步骤才能模拟体外的DNA分子扩增，LAMP反应时间更短、且对操作和仪器要求更低。

 

应用范围广

LAMP是检测界中的后起之秀， 已逐步用于包括DNA病毒、RNA病毒、细菌和寄生虫等的定性检测。在新冠病毒、HIV病毒、流感病毒、埃博拉病、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒等领域都得到了广泛的应用。业内玩家已先后开发出多种商业化LAMP试剂盒，使检测成本进一步降低，促进了LAMP技术的普及，为基层及没有实验室条件的地区进行现场快速检测（POCT）提供了方便。

特异性和灵敏度媲美PCR

相比PCR，等温扩增的特异性和灵敏度稍低，但通过优化反应可实现高特异性和高灵敏度。 

案例一

Chukwunonso O. Nzelu等人总结检测人利什曼病的14个LAMP方法中，灵敏度在80%~100%之间，特异性在94%~100%之间，灵敏度和特异性都＞90%的占比超过一半。

参考文献：https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007698

 

案例二

Barbara J. Bucher等人对比LAMP和PCR方法检测犬粪便中多房棘球绦虫卵，发现通过优化DNA的提取方法，可以使LAMP方法的灵敏度达到甚至超越PCR。

参考文献：https://doi.org/10.3390/pathogens10070847

 

美格生物LAMP系列产品推荐

 

Bst DNA聚合酶，大片段（货号:D001）

反应快速

Bst DNA聚合酶是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有 5’→3’ DNA聚合酶活性，以及很强的链置换活性，缺失5’→3’ 核酸外切酶活性。可用于LAMP等温扩增反应。

使用美格生物Bst Pro DNA Polymerase, Large Fragment，和供应商N的Bst对结核杆菌进行扩增反应，对比扩增10^5, 10^4, 10^3copies的靶标，结果显示两者性能一样优秀。







Bst Pro DNA 聚合酶，大片段（货号:D006）

Bst Pro DNA 聚合酶对野生型Bst DNA聚合酶进行了特异性改造，保留了野生型的全部特性之外可以使用50%的dUTP为原料进行扩增反应。

 

LAMP 扩增预混液（染料型）（货号:F001）

使用美格生物的LAMP 扩增预混液对非洲猪瘟病毒（ASFV）进行扩增，检测可达10copies/反应，且稳定检出。图中从左到右分别是对10000,1000,100,10拷贝数扩增得到的扩增曲线。



美格生物LAMP系列产品列表

具有最小附属切割活性的高保真Cas13变体靶向RNA降解

科学家报告了一种新型双荧光报告系统，用于检测哺乳动物细胞中的附属切割活性和筛选Cas13变异体。该团队分析了200多个工程化Cas13变体后发现了其中几个（包括Cas13d和 Cas13X）表现出有效的靶向活性，但附属切割活性显著降低。他们还发现，这些变体不存在由Cas13诱导的转录组范围的脱靶和细胞生长停滞。作者得出结论，具有最小附属切割活性的高保真Cas13变体现在可用于基础研究和治疗应用中的 RNA 靶向降解。

CRISPR快讯Vol.3 用于一管法新冠检测耐热Cas13酶的特性耐热Cas13同源物将扩大和解锁CRISPR系统在合成生物学和生物技术应用中的贡献。本文从Thermoclostridiumcaenicola中鉴定并表征了一种耐热Cas13同源物(TccCas13a)，该同源物在37-70°C的广泛温度范围内表现出良好的顺式和反式切割活性。为了证明耐热Cas13酶在生物技术应用中的实用性，文章将

CRISPR快讯Vol.2 免扩增数字RNA自动检测平台用于快速、灵敏地诊断SARS-CoV-2在当前的COVID-19大流行中，快速、灵敏地诊断病毒感染是遏制病毒传播的关键。为此，本文利用CRISPR-Cas13a和微室装置(opn-SATORI)开发了一种自动免扩增的数字RNA检测平台，该平台可在9分钟内自动完成临床标本从混合样本到RNA定量的检测过程。opn-SATORI采用Cas13a和磁

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开学啦！

美格生物竭诚为广大学子的新学期保驾护航！自8月16日起至9月30日，美格生物CRISPR蛋白系列Cas9蛋白、Cas12a蛋白、Cas12b蛋白、Cas13a蛋白、Cas14a蛋白、T7 核酸内切酶 I展开限时促销活动，选购得好礼，快来看看吧！

Cas9 蛋白

用于基因编辑，纯蛋白体系

Cas9-NLS可在sgRNA介导下，识别PAM序列NGG位点，特异性切割DNA双链。凭借其纯蛋白无干扰、低毒的安全特点，广泛用于基因编辑，可用于基因敲除和多靶点精确编辑DNA, 以Cas9核糖核蛋白RNP形式进入个体内或细胞中编辑，比如培养模式动物。



 

Cas12a 蛋白

附属切割活性强，分子诊断优选

在CRISPR诊断蛋白中，Cas12a（又称Cpf1）是在sgRNA引导下与靶标DNA特定位点结合并切割的核酸内切酶。Cas12a蛋白具有较为高效的附属切割活性，能够在较少用量的环境下实现对于DNA检测的信号放大，可与RDA、LAMP、PCR等方法搭配使用。在诊断应用中，当Cas12a检测并切割特定的目标DNA序列时，其高效切割任意ssDNA序列的活性被激活，该性质使其广泛用于各种病原体的核酸检测，例如用于人乳头瘤病毒和新型冠状病毒肺炎检测。



Cas12b 蛋白

附属切割活性强，分子诊断优选

Cas12b同样是一种依赖sgRNA介导的核酸内切酶，但其在45-65℃的中高温环境中具备更高的切割活性。Cas12b在sgRNA引导下识别并切割靶标双链DNA时，其“附属切割”活性会被激活，并高效地切割体系中的任意序列ssDNA，该性能使其逐渐流行于分子诊断领域。



Cas13a 蛋白

切割活性强

Cas13a在sgRNA引导下，可以识别并切割体系中的特异单链RNA。在切割特定RNA序列后，其“附属切割”活性会被激活，可高效地切割体系中的任意序列ssRNA。通过设计两端标记荧光基因或者其他标记物的RNA探针，可实现CRISPR/Cas13对RNA模板的检测和信号放大。当cas13a与靶标RNA结合时，它通过切割RNA探针释放荧光信号，来检测靶标RNA的存在，可用于诊断黄病毒，如寨卡病毒，登革热，西尼罗病毒和黄热病。



Cas14a 蛋白

特异性更高

Cas14a主要用于分子诊断。在CRISPR诊断蛋白系列中，Cas14a蛋白较小，比Cas9蛋白小两倍。Cas14a不受PAM位点限制，识别ssDNA序列的特异性更高，非常适用于SNP基因分型。



T7 核酸内切酶 I

常用于基因编辑结果验证

T7核酸内切酶 I，英文学名T7 Endonuclease I，可用于识别并切割不完全配对、十字形结构、交叉的以及异源双链的DNA；和缓慢切割带有切刻缺口的双链DNA。T7 核酸内切酶 I可用于基因突变、SNP、TALEN或CRISPR/Cas9形成的突变体检测，并识别错配DNA，分解四方向交叉DNA或分支DNA。



产品列表  CRISPR-Cas系列



活动时间：

2022年8月16日- 9月30日（初定）

 

活动规则：

1.活动期间下单并顺利确认订单的客户即可参加，不含经销商客户；

2.新客户下单额外赠送小米无线鼠标一个



3.活动期间购买试剂满2000元可申请 智能蓝牙音箱一个，满5000可申请空气炸锅一个，满8000可以申请SK-II大红瓶一份







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5.本活动最终解释权归广州美格生物科技有限公司所有

 

1月6日，广东深圳疫情爆发，深圳疾控新冠溯源团队凌晨五点着手病毒测序工作，仅用16小时让病毒来源一锤定音，确定为达尔塔变异株。


2月13日，江苏苏州发现新冠病毒阳性感染8例，市疾控中心快速展开病毒基因测序，24小时内确定病毒为奥密克戎变异株。


自3月份山东青岛疫情以来，市疾控基因测序小组不分昼夜与病毒赛跑，病毒基因测序结果24小时内可获。

……





  近日来，国内疫情起伏反复，累计确诊病例突破240万关口，而每一次发现首发病例后的抗疫方案部署都会涉及一项至关重要的工作——新冠病毒基因测序与溯源。

  据了解，国家对新冠病毒基因测序工作要求为72小时，得益于我国疫情以来对溯源工作的重视和建设，以及各疾控中心对人员培训和流程的优化，目前病毒溯源基本能在24小时内完成，这为每场城市抗疫战中赢得宝贵时间，对及时研判疫情、采取有效防控措施具有重要指导意义。

  为什么对病毒进行溯源如此重要
  

  在新冠肺炎疫情防控中，对病毒进行基因测序，鉴别其基因型别，以此进行溯源分析和流行病学调查，对疫情防控工作开展有重要意义。

  在当前动态清零的政策下，测定病例中病毒基因组序列对于判定分子传播链条以及病毒在社区内传播的可能代次都具有重要的指示意义。特别对于Omicron毒株，其具有隐秘性更强、传播更快等特征，导致尽管发现少数阳性患者，传播范围往往已扩散到一定区域。因此，各地区在检测到首发案例后应对病毒进行精准快速的溯源，其作用在于确定病例源和传播链。如测定的不同病例之间序列已有2-3个碱基差异很可能表明病毒在区域内已传播一段时间，应开展更有针对性的防控策略。

  而当防控工作从应急状态转为常态化，病毒基因测序与溯源的主要作用在于及时发现新的变异毒株及依据病毒序列评估其感染和流行特征。当前，全国30个省和新疆生产建设兵团均完成建设新冠病毒全基因组测序平台，为及时发现新的病毒变异型别提供重要技术平台。

  疫情以来，我国疾控中心一直通过GISAID向国际分享本地收集到的SARS-CoV-2基因组序列，当前GISAID平台已收集到来自全球172个国家和地区、超过1020万组的SARS-CoV-2基因序列，由此可见，开展病毒基因测序在国内乃至全球的疫情防控中的重要性。

  病毒变异催化基因测序与溯源需求
  前文提及，当前国内爆发的疫情主要以奥密克戎病毒株为主，其对全球新冠大流行的轨迹带来重大的改变和负面的影响，但病毒的变异脚步并没有就此停止。随着国内感染病例持续增加，病毒变异的速度也在提升，2022年国内所监测到的病毒序列数量已是2021年水平的数十倍。

 

  根据“全球新冠肺炎预测系统”预测，此次奥密克戎引发的全球疫情将会持续到明年11月。虽然当前奥密克戎的子变体BA.2占据全球新冠病毒的主导地位(全部基因测序的94%)，但奥密克戎的突变还在继续。今年1月新发现的XE毒株为奥密克戎BA.1和BA.2结合体，其传播能力已被证实再次提升（43%）。同年4月，世卫组织更是将奥密克戎的新子变体BA.4和BA.5列入了监测名单，对病毒基因持续测序和溯源，有助于对病毒变异株进行定性和监测，是防控措施的重要手段之一。

  
  另外截止至5月30日，2022年全国新冠确诊病例已达234万多例，这将近是2021年全年累计病例的153.9倍，结合奥密克戎毒株造成的多次疫情反弹和学者对其未来发展的预测，防疫工作对病毒测序和溯源的需求将是持久且巨大的。  

  

  

美格生物

超灵敏新冠病毒全基因组靶向扩增试剂盒

美格生物持续对疫情关注，自疫情以来推出超灵敏新冠病毒全基因靶向扩增试剂盒，产品质量优且稳定，广获多家疾病机构认可。



  

  产品原理

  针对病毒基因组序列设计多重PCR扩增引物，利用随机引物和oligodT对病毒正链RNA进行逆转录，随后利用多重引物对新冠病毒的全基因组进行靶向扩增。仅需少量RNA即可扩增出新冠病毒全基因序列，可完美对接二代测序和三代测序平台，结合IPH-Nano测序分析软件轻松获得新冠病毒基因组序列及变异位点信息。

  产品优势



无需病毒分离，少量RNA样品，逆转录一步法扩增


多重PCR靶向测序，1200bp引物，新冠病毒突变株全覆盖


Illumina、Nanopore等二代和三代测序平台完美兼容



  

  产品作用



根据序列进行诊断试剂盒的设计


病毒同源性分析及溯源追踪


病毒序列突变追踪


特效药或疫苗的研发


流行病学调查



  产品性能，测试效率对比

  

  



对比29对引物扩增结果，每对引物有对应测序reads数量，以最高的reads数量为100%计算不同扩增区段对应的测序reads数量；百分比接近代表引物对扩增效率相似，代表最小数据量或较少的测序时间可以获得较高的覆盖度。


红框标识出Artic引物（Version 3）在S区段有部分覆盖度很低或无法成功扩增；poolABC引物（美格生物）能很好的覆盖整个新冠病毒基因组，保证测试效率。



 

  更多产品，助力病毒测序



 

近日，国家科技部火炬中心对《企业创新积分制首批试点国家高新区创新积分500企业》进行公布，广州美格生物科技有限公司（下文简称为美格生物）荣获成长期创新积分企业新头衔。