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cas9、cas12、cas13、cas14蛋白所延伸的分子诊断技术

近年来，基于等温扩增的核酸检测技术已大量建立并广泛应用于人类疾病检测中。其中，环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, 下文统称LAMP）关注度尤为突出，拥有接近一半的恒温检测市场占有率。

LAMP技术是日本学者Notomi在2000年发明的，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物。在链置换酶Bst DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下，与特殊设计的引物形成“环”结构，在60~65℃进行恒温扩增，大约15~60分钟就可实现10^9~10^10倍的核酸扩增，操作简单。其优点为快速高效，且无需专业的设备，弥补了传统PCR技术的不足。




 

简单快速







传统升降温式PCR扩增DNA片段分3个阶段，变性、退火和延伸，每个阶段对应不同的温度，高温（95℃）变性，DNA双链变成单链；降温（60℃）退火，引物与模板互补配对；适温（72℃）延伸，形成新的DNA双链。每经历这三步就是一个PCR反应循环，DNA量翻一番，PCR通常做30-45个循环，反应时间长达40分钟到2个小时，且升降温式PCR对于仪器的要求较高。

LAMP等温扩增技术则不需要热循环系统，就可以进行核酸扩增，在其扩增阶段，利用4种特异引物和高活性链置换DNA聚合酶，使得链置换DNA合成在不停地自我循环，如果再添加环状引物，20~30分钟后即可检测到扩增产物。相比于常规PCR需要经过严格的变性、退火、延伸等步骤才能模拟体外的DNA分子扩增，LAMP反应时间更短、且对操作和仪器要求更低。

 

应用范围广

LAMP是检测界中的后起之秀， 已逐步用于包括DNA病毒、RNA病毒、细菌和寄生虫等的定性检测。在新冠病毒、HIV病毒、流感病毒、埃博拉病、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒等领域都得到了广泛的应用。业内玩家已先后开发出多种商业化LAMP试剂盒，使检测成本进一步降低，促进了LAMP技术的普及，为基层及没有实验室条件的地区进行现场快速检测（POCT）提供了方便。

特异性和灵敏度媲美PCR

相比PCR，等温扩增的特异性和灵敏度稍低，但通过优化反应可实现高特异性和高灵敏度。 

案例一

Chukwunonso O. Nzelu等人总结检测人利什曼病的14个LAMP方法中，灵敏度在80%~100%之间，特异性在94%~100%之间，灵敏度和特异性都＞90%的占比超过一半。

参考文献：https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0007698

 

案例二

Barbara J. Bucher等人对比LAMP和PCR方法检测犬粪便中多房棘球绦虫卵，发现通过优化DNA的提取方法，可以使LAMP方法的灵敏度达到甚至超越PCR。

参考文献：https://doi.org/10.3390/pathogens10070847

 

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Bst DNA聚合酶，大片段（货号:D001）

反应快速

Bst DNA聚合酶是Bacillus stearothermophilus DNA聚合酶的一部分，具有 5’→3’ DNA聚合酶活性，以及很强的链置换活性，缺失5’→3’ 核酸外切酶活性。可用于LAMP等温扩增反应。

使用美格生物Bst Pro DNA Polymerase, Large Fragment，和供应商N的Bst对结核杆菌进行扩增反应，对比扩增10^5, 10^4, 10^3copies的靶标，结果显示两者性能一样优秀。







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Bst Pro DNA 聚合酶对野生型Bst DNA聚合酶进行了特异性改造，保留了野生型的全部特性之外可以使用50%的dUTP为原料进行扩增反应。

 

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使用美格生物的LAMP 扩增预混液对非洲猪瘟病毒（ASFV）进行扩增，检测可达10copies/反应，且稳定检出。图中从左到右分别是对10000,1000,100,10拷贝数扩增得到的扩增曲线。



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具有最小附属切割活性的高保真Cas13变体靶向RNA降解

科学家报告了一种新型双荧光报告系统，用于检测哺乳动物细胞中的附属切割活性和筛选Cas13变异体。该团队分析了200多个工程化Cas13变体后发现了其中几个（包括Cas13d和 Cas13X）表现出有效的靶向活性，但附属切割活性显著降低。他们还发现，这些变体不存在由Cas13诱导的转录组范围的脱靶和细胞生长停滞。作者得出结论，具有最小附属切割活性的高保真Cas13变体现在可用于基础研究和治疗应用中的 RNA 靶向降解。

CRISPR快讯Vol.3 用于一管法新冠检测耐热Cas13酶的特性耐热Cas13同源物将扩大和解锁CRISPR系统在合成生物学和生物技术应用中的贡献。本文从Thermoclostridiumcaenicola中鉴定并表征了一种耐热Cas13同源物(TccCas13a)，该同源物在37-70°C的广泛温度范围内表现出良好的顺式和反式切割活性。为了证明耐热Cas13酶在生物技术应用中的实用性，文章将